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組換えアデノウイルス


組換えアデノウイルスに関して
組換えウイルス作製用シャトルベクタ
組換えアデノウイルスに関する参考資料

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組換えアデノウイルスに関して

当開発室では、国内ならびに海外において産出された遺伝子材料の寄託をうけ、検定後保存し品質管理したリソースを提供しています。本組換えアデノウイルスは、研究で実際に使用されたクローンならびに当開発室で独自に開発したクローンを収集しており、他にはないユニークなものが多数あります。
理研BRC・遺伝子材料開発室では、組換えウイルスおよびウイルス作製ベクターを収集しております。
新たに組換えウイルスまたは組換えウイルス作製用ベクター等の研究材料を開発された方は、ぜひ、当方に御寄託下さいますようお願い申し上げます。
ただし、当バンクは、病原性ウイルスは扱うことができませんので、あらかじめご了承願います。

組換えアデノウイルスを受取ったら

組換えアデノウイルスを受取ってから精製するまでの手順の概要です。操作手順の詳細は、「組換えウイルスプロトコール集（日本語）」の「挿入遺伝子とRCAの確認」をご覧下さい。また、操作手順は「組換えアデノウイルス作製マニュアル ～クローン化ゲノム導入法～」にも記載されています。

  1. 組換えアデノウイルスの増幅
    • 理研DNA Bankが提供する組換えアデノウイルスはウイルス感染細胞ライセートとしてお送り致します。力価は測定していませんが，おおよそ106-8pfu/mlの液を100 μl お送りいたします。お受け取り後は直ちに培養を開始してください。直ちに培養ができない場合は-80℃で保管し、なるべく早く培養して下さい。
    • 操作方法
      • 10 cmコラーゲンコートディッシュに培養した293 細胞（培養液10ml, 約9×106cells）を用意する。
      • ウイルス液を100 μl感染させる（「組換えアデノウイルス作製マニュアル ～クローン化ゲノム導入法～」Protocol C-1 ,3, 4 次ウイルス感染プロトコール参照）
      • 約3～4 日後に細胞が死滅したら、約10mlの培養液を細胞ごと（死滅細胞ごと）50 mLチューブに回収する。すぐに使わない場合は粗ウイルス液としてそのまま－80℃に保存する。すぐに使用する場合は、密閉超音波破砕または凍結融解し、ウイルスを遊離させ,9,400 g、10 分、4℃で遠心して上清を回収しウイルス液として使用する（ウイルス液約10mlが得られる）。残りは、蓋がネジ式のチューブに分注して-80℃に保存する。 ・この後、「組換えアデノウイルス作製マニュアル ～クローン化ゲノム導入法～」の「組換えウイルスの超遠心による大量調製」に従って、ウイルス粒子を精製してください。
      • 組換えアデノウイルスの輸送ならびに保存時の安定性についてはUgai, H. et al., Jpn. J. Cancer Res., 93, 598-603 (2002).をご覧ください。
      • 組換えアデノウイルス増幅にはHEK293細胞 (RCB1637)をご使用ください。
  2. 配列と構造の検査
    • 組換えアデノウイルスに限らず、組換えDNAクローンは突然変異を起こす可能性があります。そこで、組込み遺伝子（ファイバー変異体アデノウイルスはファイバー領域も）の性状を実験の前にご自身で調べて下さい。その方法として、PCR、DNAシーケンシングあるいはウエスタンブロッティングが考えられます。
  3. 自律増殖ウイルス混入の検査
    • 理研DNA Bankの組換えアデノウイルスは、そのほとんどがCOS-TPC法により作製されており(Miyake S. et al., 1996)、自律増殖可能なアデノウイルス(Replication Competent Adenovirus, RCA)が混入する恐れがあります。また、組換えアデノウイルス増殖過程でも宿主であるHEK293細胞の持つE1遺伝子を組み換えにより獲得することが報告されています。そこで、組換えアデノウイルスをしようする前には、RCAが存在しないことを確認する必要があります。Suzuki E et al. (2004)にその方法を掲載しておりますのでご覧下さい。
    • 自律増殖可能なアデノウイルスの検出にはHeLa細胞 (RCB0007)をご使用ください。
  4. 組換えアデノウイルスの精製
    • 組換えアデノウイルスの簡便な精製法は、「組換えウイルスプロトコール集（日本語）」のほか、Ugai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 331: 1053-1060 (2005)、 鵜飼ら、実験医学、羊土社、24, 981-985 (2006)、または、「組換えアデノウイルス作製マニュアル ～クローン化ゲノム導入法～」にも記載されています。

組換えウイルス作製用シャトルベクター

組換えウイルス作製用シャトルベクター使用時の注意

  • 第二種使用等を目的とした遺伝子組換え生物です。
  • 宿主の名称ならびに組換え核酸の名称は、各クローンの詳細情報をご参照下さい。
  • 本ベクターは定められた実験条件下で定められた宿主細胞に導入した時に組換えウイルスを産生する様に設計されていますが、それ以外の条件下でウイルスが産生される可能性は否定できません。従いまして、ウイルス産生以外の目的で本ベクターを使用される場合は、十分に注意して下さい。

概要

  • 組換えアデノウイルスを産生するためのベクター（シャトルベクター）です。本クローンを然るべき条件下で定められた細胞株に導入することにより、組換えウイルスを得ることができます。（搭載遺伝子による細胞毒性等の理由から、一部のシャトルベクターからは組換えウイルスを産生できない場合があります）
  • 当開発室では基本業務として、国内ならびに海外において産出された遺伝子材料の寄託をうけ、検定後保存し品質管理したリソースを提供しています。本シャトルベクターは、研究で実際に使用されたクローンならびに当開発室で独自に開発したクローンを収集しており、他にはないユニークなものが多数あります。
  • 寄託者から提供された配列ならびに検定の一環として行った末端塩基配列を、ホームページ上で公開しています。挿入遺伝子の両端をベクター側のプライマーを使用してシークエンスした結果（ドラフトシークエンス）を提示しています。この配列は寄託時にクローンに添えられる寄託書類の記載内容と比較することを目的として得たもので、リソースの全塩基配列を保証するものではありません
  • 組換えアデノウイルス産生用シャトルベクター（コスミドベクター）は、「アデノ落とし」によりプラスミドベクターに変換可能であり（制限酵素サイトの制約による一部のクローンを除く）、それにより発現ベクターとして使用できます。「アデノ落とし」については「実験医学 Vol. 21, No. 7 (５月号) クローズアップ実験法、寺島他 pp.931-936」をご覧下さい。

シャトルベクターからどの様にしてアデノウイルス粒子を得るのか？

  • 完全長ゲノム導入法
    • 下記のベクターをもとに作製されたシャトルベクターは、HEK293細胞に遺伝子導入することによりウイルス粒子の産生が可能です (Fukuda et al., 2006).
      • RDB3120 pAxcwit
      • RDB3121 pAxCAwtit
      • RDB5212 pAxcwit2
      • RDB5213 pAxCAwtit2
      • RDB5214 pAxCALNLwtit2
      • RDB5215 pAxEFwtit2
  • ＣＯＳ－ＴＰＣ法
    • その他のシャトルベクターは、DNA-TPCを用い、「ＣＯＳ－ＴＰＣ法」によりウイルス粒子を産生させます (Miyake et al., 1996)。DNA-TPC は Ad5-dlX (cat# RDB01747) から自作するほか、タカラバイオから入手可能です。
  • 産生した組換えアデノウイルスも当開発室から提供可能です。本カタログの組換えアデノウイルスの項をご覧下さい。

Shuttle vector of Sugano full-length human cDNA

東京大学医科学研究所 菅野純夫博士より提供していただいたヒト完全長cDNAを搭載したShuttle Vector of Sugano Full-Length Human cDNAを提供しています。オリゴキャップ法により単離構築されたcDNAクローンからインサートを切出し、組換えアデノウイルス作製用シャトルベクターに組込みました。組換えアデノウイルスの作製の他、「アデノ落とし」によりアデノウイルスゲノムの大部分を除いたプラスミドベクターを得ることができ、それを発現ベクターとして利用可能です。

 

目的遺伝子を持つシャトルベクターを構築する

組換えアデノウイルスに関する参考資料

組換えアデノウイルスの取扱い

  • Ugai H, Yamasaki T, Hirose M, Inabe K, Kujime Y, Terashima M, Liu B, Tang H, Zhao M, Murata T, Kimura M, Pan J, Obata Y, Hamada H, Yokoyama KK. (2005) Purification of infectious adenovirus in two hours by ultracentrifugation and tangential flow filtration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331: 1053-1060.
  • Suzuki E, Murata T, Watanabe S, Kujime Y, Hirose M, Pan J, Yamazaki T, Ugai H, Yokoyama KK. (2004) A simple method for the simultaneous detection of E1A and E1B in adenovirus stocks. Oncol Rep. 11: 173-178.
  • H. Ugai, E. Suzuki, K. Inabe, T. Murata, H. Hamada, K. K. Yokoyama (2003) Spontaneous mutations in the human gene for p53 in recombinant adenovirus during multiple passages in human embryonic kidney 293 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 448-456.
  • 鵜飼英世、寺島美保、村田武英、横山和尚：「組換えアデノウイルスの迅速な精製法 」実験医学、羊土社、24, 981-985 (2006).
  • 寺島 美保、近藤 小貫、鐘ヶ江 裕美、斎藤 泉 (2003) アデノウイルスベクターの簡便な作製法. 実験医学, 21: 931-936.
  • 実験医学別冊、新訂新遺伝子工学ハンドブック、改訂第３版、村松正實、山本雅編、1999年、(株)羊土社
  • 実験医学別冊、バイオマニュアルUPシリーズ、改訂版分子生物学研究のためのタンパク実験法、竹縄忠臣編、1998年、(株)羊土社
  • 別冊実験医学、ザ・プロトコールシリーズ、遺伝子導入＆発現解析実験法、斎藤泉、菅野純夫編集、1997年、(株)羊土社
  • 実験医学別冊、バイオマニュアルUPシリーズ、遺伝子治療の基礎技術、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編集、1996年、(株)羊土社
  • ウイルス実験プロトコール、永井美之、石浜明監修、小林信之、永田恭介編集、1995年、メジカルビュー社
  • 実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ、遺伝子導入と発現・解析法、横田崇、新井賢一編集、1994年、(株)羊土社

組換えアデノウイルスの安定性

  • Ugai, H., Watanabe, S., Suzuki, E., Tsutsui-Nakata, H., Yokoyama, K.K., Murata, T. (2002) Stability of a recombinant adenoviral vector: optimization of conditions for storage, transport and delivery. Jpn J Cancer Res., 93: 598-603.
  • Croyle, M.A., Yu, Q.C., Wilson, J.M. (2000) Development of a rapid method for the PEGylation of adenoviruses with enhanced transduction and improved stability under harsh storage conditions. Hum Gene Ther. 11 (12): 1713-1722.
  • Nyberg-Hoffman, C., Aguilar-Cordova, E. (1999) Instability of adenoviral vectors during transport and its implication for clinical studies. Nat Med. 5 (8): 955-957.

完全長ゲノム導入法による組換えアデノウイルスの作製

COS-TPC法による組換えアデノウイルスの作製

  • Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, Harada S, Sato Y, Takamori K, Tokuda C, Saito I. (1996) Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome.
    Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324.

自律増殖可能なアデノウイルス(Replication Competent Adenovirus, RCA)

  • Suzuki E, Murata T, Watanabe S, Kujime Y, Hirose M, Pan J, Yamazaki T, Ugai H, Yokoyama KK. (2004) A simple method for the simultaneous detection of E1A and E1B in adenovirus stocks. Oncol Rep. 11: 173-178.
  • 村田武英、鵜飼英世、鈴木恵理香、横山和尚 (2001) 組換えアデノウイルスの安全性、細胞工学、Vol. 20, No. 9, 1250-1254.
  • Fallaux FJ, Kranenburg O, Cramer SJ, Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC, Van Der Eb AJ. (1996). Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 7: 215-222.
  • Lochmuller H, Jani A, Huard J, Prescott S, Simoneau M, Massie B, Karpati G, Acsadi G. (1994). Emergence of early region 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication-defective adenovirus recombinants (delta E1 + delta E3) during multiple passages in 293 cells. Hum. Gene Ther. 5: 1485-1491.
  • Zhu J, Grace M, Casale J, Chang AT, Musco ML, Bordens R, Greenberg R, Schaefer E, Indelicato SR. (1999). Characterization of replication-competent adenovirus isolates from large-scale production of a recombinant adenoviral vector. Hum. Gene Ther. 10: 113-121.

293細胞のE1遺伝子を獲得することによるRCAの発生

  • Hehir KM, Armentano D, Cardoza LM, Choquette TL, Berthelette PB, White GA, Couture LA, Everton MB, Keegan J, Martin
    JM, Pratt DA, Smith MP, Smith AE, Wadsworth SC (1996). Molecular characterization of replication-competent variants of adenovirus vectors and genome modifications to prevent their occurrence. J. Virol. 70: 8459-8467.

RCA発生を抑制した宿主細胞

  • Schiedner G, Hertel S, Kochanek S (2000) Efficient transformation of primary human amniocytes by E1 functions of Ad5: generation of new cell lines for adenoviral vector production. Hum. Gene Ther. 11: 2105-2116.
  • Gao GP, Engdahl RK, Wilson JM (2000). A cell line for high-yield production of E1-deleted adenovirus vectors without the emergence of replication-competent virus. Hum. Gene Ther. 11: 213-219.
  • Fallaux FJ, Bout A, van der Velde I, van den Wollenberg DJ, Hehir KM, Keegan J, Auger C, Cramer SJ, van Ormondt H, van
    der Eb AJ, Valerio D, Hoeben RC (1998). New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Hum. Gene Ther. 9: 1909-1917.

Creが動物細胞に与えるtoxicity

  • Baba, Y., Nakano, M., Yamada, Y., Saito, I., Kanegae, Y. (2005). Practical range of effective dose for Cre recombinase-expressing recombinant adenovirus without cell toxicity in mammalian cells. Microbiol. Immunol. 49 (6): 559-570.

Examples of PCR Primers for Detection of Adenoviruses



Name Positiona Sequence VID of RVD
Detection of E1A
E1AF1b 560-595 5′-ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC GGA GGT GTT ATT AC-3′ S00797
E1AF2c 626-661 5′-CTG ATC GAA GAG GTA CTG GCT GAT AAT CTT CCA CC-3′  
E1AR2b 1545-1511 5′-TTA TGG CCT GGG GCG TTT ACA GCT CAA GTC CAA AG-3′ S00797
jpz1d 880-899 5′-GGGTCCGGTTTCTATGCCAA-3′ S00026
jpz2d 1099-1077 5′-GCCACAGGTCCTCATATAGCAAA-3′ S00026
Detection of E1B
E1BF1c 2002-2035 5′-AGT TTT ATA AAG GAT AAA TGG AGC GAA GAA ACC C-3′  
E1BF2c 2097-2131 5′-ACA CAA GAA TCG CCT GCT ACT GTT GTC TTC CGT CC-3′ S00796
E1BR1c 2495-2462 5′-AGT GGT CAG CTG CTC TAT GGA ATA CTT CTG CGC G-3′  
E1BR2c 3156-3122 5′-TGC GAG AGT GGC TGG CTA CGT GAA TGG TCT TCA GC-3′ S00796
E1BR3c 3285-3251 5′-TGC TCT CGG GCT CAA GCA ATA TCT TAG TGT GAC TC-3′  
jpz3d 2392-2413 5′-CCAGACACCGTCCTGAGTGTAT-3′ S00027
jpz4d 2628-2607 5′-CGTTCCCAGAAATGTAGCAACA-3′ S00027
Detection of pIX
jpz5d 3473-3494 5′-CGCTGAGTTTGGCTCTAGCGAT-3′ S00028
jpz6d 3698-3679 5′-CATCACATTCTGACGCACCC-3′ S00028
Detection of insert cDNA in CAG expression unit
PAXCAF1   5′-GGCTTCTGGCGTGTGACCGGC-3′  
PAXCALNLF1   5′-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCC-3′  
PAXCAR1   5′-CAGAGGGAAAAAGATCTCAGTGG-3′  

aPositions of nucleotide sequences correspond to those of the nucleotide sequence of human adenovirus type 5 (Genbank accession number M73260).

bUgai, H., Suzuki, E., Inabe, K., Murata, T., Hamada, H., Yokoyama, K.K. (2003) Spontaneous mutations in the human gene for p53 in recombinant adenovirus during multiple passages in human embryonic kidney 293 cells.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 448-456.
cSuzuki, E., Murata, T., Watanabe, S., Kujime, Y., Hirose, M., Pan, J., Yamazaki, T., Ugai, H., Yokoyama, K.K. (2004) A simple method for the simultaneous detection of E1A and E1B in adenovirus stocks.

Oncol. Rep. 11: 173-178.
dZhu, J., Grace, M., Casale, J., Chang, A.T., Musco, M.L., Bordens, R., Greenberg, R., Schaefer, E., Indelicato, S.R. (1999) Characterization of replication-competent adenovirus isolates from large-scale production of a recombinant adenoviral vector.

Human Gene Ther. 10: 113-121.

アデノウイルスの感染効率

  • Wickham et al., Nat. Biothech. 14, 1570-1573, 1996.
  • Mizuguchi and Hayakawa, Gene 285, 69-77, 2002.
  • Li et al., Mol. Cancer Ther. 4, 1850-1859, 2005.
  • Huch et al., Hum. Gene Ther. 17, 1-14, 2006.
  • Yoshida et al., Hum. Gene Ther. 9, 2503-2515, 1998.
  • Nakamura et al., Hum. Gene Ther. 13, 613-626, 2002.
  • Steinwaerder et al., Hum. Gene Ther. 11, 1933-1948, 2000.
  • Dehari et al., Cancer Gene Ther. 10, 75-85, 2003.
  • Bruning and Runnebaum, Gene Ther. 10, 198-205, 2003.
  • Shayakhmetov and Lieber, J. Virol. Nov, 10274-10286, 2000.
  • Israel et al., J. Virol. June, 5215-5221, 2001.
  • Michiels F et al., Nat. Biotechnol. 20, 1154-1157, 2002.
  • Michiels F et al. (2002). Arrayed adenoviral expression libraries for functional screening. Nat. Biotechnol. 20: 1154-1157.
Table of infection efficiency of human cells and cell lines with standard Ad 5 viruses at the indicated Multiplicity of Infection (MOI). (form Michiels F et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 1154-1157)
Cell type Origin of cells % efficiency MOI
Primary cells
Adipocytes Human liposuction tissue 25 2500
Bronchial epithelial cells Human lung 70 1000
Mast cells Cultured from human CD34+ cord blood cells 25 2500
CD14+ Monocytes Human peripheral blood 10 2500
CD3+ T-lymphocytes Human peripheral blood, naive 3 2500
Human Osteoblasts Differentiated mesenchymal stem cells 75 3000
HUVEC Human umbilical cord vascular endothelium 100 1000
Mesenchymal cells Human pluripotent bone marrow progenitors <10 1000
Pre-adipocytes Human liposuction tissue 40 2500
GM09503 Human foreskin fibroblasts 28 1000
Cell lines
A549 Human lung carcinoma 90 250
BxPC3 Pancreatic cancer 50 1000
HaCat Human keratinocyte 47 1000
HCT116 Human fibroblast 75 100-500
Hela-cells Human cervix tumor 90 1000
HepG2 Human liver carcinoma 88 50
Jurkat Human T lymphoma 81 2500
K562 Human erythroid leukemia 31 1000
MCF-7 Human breast cancer 58 1000
Ramos Human B-cell lymphoma 13 2500
SH-SY5Y Human neuronal tissue 99 250
T47D Human breast cancer 68 375
U2OS Human osteosarcoma 87 100

 

(GRP0046j 2002.01.01 T.M.)

2023.01.30



 

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